دراسة القياس الجزئي لطعام الكلب المبثوق الذي يحتوي على كائنات دقيقة بروبيوتيك

Source: Advances in Microbiology, 2012, 2, 436-440 dx.doi.org/10.4236/aim.2012.24055- نشرت على الإنترنت في ديسمبر 2012 (http://www.SciRP.org/journal/aim)

١. المقدمة

تم إجراء محاولات عديدة لإنتاج علف أو منتج (منتجات) غذائي مبثوق مع عدد بكتيريا بروبيوتيك مستقرة وقابلة للحياة على مدار فترة الصلاحية الكاملة للمنتج الناقل [1-3]. ومع ذلك ، فإن تحديد عدد البكتيريا،  وخاصة تقييم نموها ونشاطها الأيضي في الأطعمة المبثوقة ومنتجات الأعلاف عن طريق التفريغ وما إلى ذلك ، لا يمكن اعتباره دقيقًا ومريحًا بشكل كافٍ.

لقد ثبت أن توليد الحرارة عن طريق المزارع الميكروبية يمكن استخدامه للمراقبة المباشرة لنمو الخلايا واستقلابها [10-4]. تعتبر القياسات الحساسة للغاية لتدفق الحرارة باستخدام القياس الدقيق من أكثر التقنيات جاذبية لدراسة ومراقبة النشاط الأيضي للبكتيريا في الوسائط السائلة غير الشفافة والمصفوفات الصلبة [11-13]. يمكن تطبيقه بنجاح في دراسات عمليات التلف وتحديد العمر الافتراضي للمنتجات التي تحتوي على ميكروبات [8،14­16] ، في الواقع في جميع الحالات التي تكون فيها إمكانيات الطرق البصرية وغيرها من الطرق الفيزيائية محدودة بسبب عدم شفافية المادة [18-17].

تمت دراسة نمو البكتيريا في منتجات أغذية الكلاب الجافة المبثوقة تحت الاسم التجاري بروبيوتيك لايف     (باكترفيلد س.أ. ، لوكسمبورغ) المزعوم أنها تحتوي على مكون بروبيوتيك من المكورات المعوية البرازية

.  TAM III في العمل الحالي باستخدام جهاز مراقبة النشاط الحراري متعدد القنوات (NCIMB10415)

٢. المواد والأساليب

٢. ١.  عينات

تم إجراء التجارب على طعام الكلاب الجاف في شكل أطعمة مقذوفة تحت اسم العلامة التجارية بروبيوتيك لايف (باكترفيلد س.أ. ، لوكسمبورغ) التي تحتوي حسب المنتج على بكتيريا بروبيوتيك القابلة للحياة  

 خلال كامل فترة العمر الافتراضي للمنتج ( 15 شهرًا)  (NCIMB10415) المكورات المعوية البرازية

 لكل جرام  ١٠^٦CFU في درجة حرارة الغرفة. تركيز البكتيريا كما هو معلن على العبوة هو بمعدل

من طعام الكلاب. تم استخدام ثلاثة منتجات غذائية للكلاب متوفرة تجاريًا ومختلفة حسب عمر الكلاب (الكبار والبالغين) وحسب الذوق (تركيبات السلمون والدجاج) في التجارب: دجاج وأرز بروبيوتيك لايف للبالغين ، وسلمون وأرز بروبيوتيك لايف للبالغين و دجاج مع أرز بروبيوتيك لايف للكبار. تم استلام جميع عينات طعام الكلاب المستخدمة في التجارب مبدئيًا في أكياس منفصلة سعة 1.5 كجم مغلقة بإحكام ، مع تاريخ انتهاء الصلاحية ٢٠١٢/١١/٢٣ ويستخدم طازجة في منتصف العمر الافتراضي للمنتج المطالب به . تم فتح جميع الأكياس في جو معقم قبل التجارب مباشرة. بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة التركيز البكتيري الجاف من )NCIMB10415 نفس سلالة البكتيريا الموجودة في طعام الكلاب ( المكورات المعوية البرازية

 تاريخ انتهاء الصلاحية  UK, Batch No BN 29094) المقدم من قبل بروبيوتيك الدولية المحدودة

CFU ١٠^١٠ كعينة مرجعية لتركيبات طعام الكلاب. احتوى التركيز البكتيري على (١١/٢٠١٣

لكل جرام من المسحوق وفقًا للمنتج.

٢.٢. تحضير العينة والظروف التجريبية

تم طحن أطعمة الكلاب الجافة من أنواع مختلفة ومنخلها إلى جزيئات دقيقة (أقل من 0.05 مم). بعد ذلك تم وزن العينات في أنابيب بلاستيكية معقمة من نوع فالكون. كانت كتلة كل عينة حوالي 0.5 جرام. تم نقل العينات بشكل معقم إلى 3 مل أمبولات ميكروكالوريمتر معقم.

 المعقم ، المعدل إلى الرقم الهيدروجيني = 2 MilliQ اعتمادًا على الظروف التجريبية ، تمت إضافة ماء

 (الرقم الهيدروجيني المكافئ لمعدة الكلب [19]) ، أو إلى الرقم الهيدروجيني = 7 (القيمة المحايدة) ، إلى طعام الكلاب الجاف المطحون في نسبة الكتلة 1: 1. تم قياس الأس الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس

 باستخدام قطب كهربائي معاير S20 Seven Easy Mettler Toledo الهيدروجيني

. تم تعقيم جميع المحاليل مسبقًا عن طريق التعقيم عند 121 درجة InLab 413 Mettler Toledo

مئوية لمدة 15 دقيقة. كمرجع ، تم أيضًا تحليل عينات من التركيز البكتيري الجاف غير المخفف.

PCA من أجل تحديد التركيز البكتيري الأولي في طعام الكلاب المطحون على

تم إجراء جميع التركيبات الغذائية الثلاثة للكلاب (Plate Count Agar, Scharlau, Spain)

وتركيز البكتيريا الجافة.

٣.٢. القياس الدقيق

، مقياس دقيق متعدد القنوات  (24-channels, TA Instruments, US) TAM III تم استخدام

للتوصيل الحراري لمراقبة نمو الخلايا في عينات طعام الكلاب وتركيز البكتيريا. تم وصف بناء وتشغيل

.[8]  Wadsö سابقًا بواسطة TAM III مقياس المسعر

تم تحليل منحنيات وقت القدرة المتناهية الصغر كما وصفها كابانوفا [10]. أجريت التجارب المسعرية عند درجة حرارة ثابتة للحضانة عند 37 درجة مئوية (ما يعادل درجة حرارة جسم الكلاب [20]) باستخدام 3 مل أمبولات مسعرية. تم إجراء جميع تجارب المسعرات في ثلاثة متوازيات وتم تطبيع منحنيات وقت الطاقة التي تم الحصول عليها لكل جرام من طعام الكلاب. تم استخدام منحنيات وقت الطاقة المتوسطة لثلاثة أشواط متوازية لمزيد من التحليل.

٣. النتائج والمناقشة

 (NCIMB10415 يوضح الشكل ١ منحنيات القوة والوقت المتوسطة لنمو المكورات المعوية (

في تركيبات مختلفة من طعام الكلاب في حالة العينات الجافة وفي العينات المبللة بقيمتين مختلفتين للأس الهيدروجيني.

الشكل ١: منحنيات وقت الطاقة لنمو بكتيريا البروبيوتيك في ثلاثة أغذية مختلفة للكلاب: عينات جافة

عند قيمتين مختلفتين للأس الهيدروجيني (الرقم الهيدروجيني = 2 (AC و AS و SC) ومرطبة

والرقم الهيدروجيني = 7).

 ، والذي كان منخفضًا جدًا ، µW0.55  كان الانحراف المعياري لمعدل منحنيات وقت الطاقة

مما يؤكد قابلية استنساخ عالية لطريقة المسعرات.

 ويتم عرض جميع القيم العددية لمنحنيات Kabanova [9] تم تحليل منحنيات وقت الطاقة وفقًا لـ

وقت الطاقة المعالجة في الجدول 1

كان طول مرحلة التأخر 3.9 ± 0.72 ساعة (في المتوسط) عند الرقم الهيدروجيني 7 (الرقم الهيدروجيني المحايد). تمت إطالة مرحلة التأخر بمقدار ساعة واحدة ، حتى 4.9 ± 0.2 ساعة (في المتوسط) عند درجة حموضة 2 (درجة حموضة منخفضة) ، وهو مستوى الأس الهيدروجيني في معدة الكلاب [13]. يمكن تفسير إطالة مرحلة التأخر عند درجة حموضة منخفضة من خلال تأثير الإجهاد الحمضي على بكتيريا الكائنات الحية المجهرية.

 لبكتيريا المكورات المعوية البرازية (μmax. W / h كان متوسط معدل النمو الأقصى المحدد (

هو نفسه عمليًا عند مستويات الأس الهيدروجيني المنخفضة والمحايدة (0.5209 ± 0.0634 واط / ساعة و 0.5391 ± 0.0539 واط / ساعة في المقابل).

 عند درجة الحموضة المحايدة (S_exp. J / g) كان متوسط الحرارة الناتجة خلال المرحلة الأسية

في حالة الأس الهيدروجيني الحمضية. 15،33 ± 0.90 J / g و 13،67 ± 0.74 J / g

 [10].L. lactis IL1403 التي حددناها لـ  2.58 ± 0.44 * 10^-9 J / cfu Y_Q باستخدام قيمة

تم حساب متوسط عدد البكتيريا التي نمت أثناء النمو الأسي

(N_exp, cfu/g – 5.93*10⁹ cfu/g at neutral pH and 5.29*10⁹ cfu/g at low pH)

-انظر الجدول 1

هي نفسها Y_Q يجب اعتبار تقديرات الكتلة الحيوية التي تم الحصول عليها موثوقة ، حيث كانت قيم

 4,22*10^-9 J/cfu،  [21] لعينات التربة  5,53*10^-8 J/cfu عمليًا في الأوراق المختلفة:

  للمكورات العنقودية الذهبية والإشريكية القولونية على التوالي [22].3,4*10^-8 J/cfuو

كانت الحرارة الإجمالية الناتجة خلال كامل فترة النشاط الديناميكي الحراري (الطول الكامل لمنحنيات

) هي نفسها عمليًا في كل من الأس Stot. J / gالطاقة المسجلة ، وجميع مراحل نمو البكتيريا -  وقت

الهيدروجيني المدروس. كان متوسط إجمالي الحرارة الناتجة عند الأس الهيدروجيني المحايد

 عند درجة حموضة منخفضة ، والتي تتوافق مع 35,92 ± 0.78 J/g and 33,88 ± 1.23 J/g

 على التوالي. حققت أعداد البكتيريا التي نمت خلال 1.39*10⁹ cfu/g and 1.31*10⁹ cfu/g

 (N_tot, cfu/g) والبكتيريا التي نمت أثناء النمو الكامل  (N_exp, cfu/g) مرحلة النمو الأسي

  في المقابل عند قيمتي الأس الهيدروجيني.cfu / g نفس المستويات من 10⁹ و 10¹⁰

 دجاج وأرز للبالغين،  :AC( جميع الصيغ الثلاثة من طعام الكلاب بروبيوتيك لايف

: دجاج وأرز للكبار) المخصب ببكتيريا بروبيوتيك من AS: سلمون وأرز للبالغين،  AS

 كان لها نفس العدد البكتيري الأولي في المتوسط (NCIMB10415) المكورات المعوية البرازية

 الواردة في الجدول 2 . كان متوسط PCA تم تأكيد من خلال تحديد العينات على cfu/g 10⁶

 وفقًا للنتائج 2,86*10⁶ ± 5,31*10⁵ cfu/g تركيز البكتيريا في جميع تركيبات أغذية الكلاب الثلاثة

 لكل جرامE. faecium 10⁶ cfu المعروضة في الجدول 2 . وهذا يؤكد ادعاء المنتج متوسط حمل

 في المنتج.

pH ودرجة الحموضة PCA الجدول 2. أعداد البكتيريا على قيم الأنيسول الخماسي الكلور

لتركيبات طعام الكلاب المختلفة وتركيز البكتيريا:  

من المعروف أن انخفاض درجة الحموضة في معدة الكلاب يعتبر حاجزًا لبكتيريا البروبيوتيك. تعد القدرة على الحفاظ على الصلاحية أثناء المرور عبر الحاجز الحمضي في المعدة شرطًا أساسيًا لمزيد من الاستعمار الناجح للأمعاء المضيفة بواسطة بكتيريا البروبيوتيك. تمكنت بكتيريا المكورات المعوية البرازية الموجودة في طعام الكلاب من تركيبات بروبيوتيك لايف من إظهار نشاط استقلابي قوي بقيمة منخفضة من الرقم الهيدروجيني الحمضي ، مما أكد حقيقة أن المكورات المعوية البرازية يمكن أن يتحمل المرور عبر الحاجز الحمضي لمعدة الكلب ويسكن الأمعاء بعد ذلك . تم تأكيد قدرة البكتيريا بروبيوتيك المكورات المعوية البرازية

، على الحفاظ على النشاط طوال المرور عبر الحاجز الحمضي المعدي للكلاب في (NCIMB10415)

. (EFSA, [23]) تجارب هيئة سلامة الغذاء الأوروبية

كشف تحليل منحنيات وقت الطاقة أن المدة الزمنية اللازمة لبكتيريا البروبيوتيك لاستعادة نشاطها في الكائن الحي المضيف بعد الاستهلاك ، وطول مرحلة التأخر ، كانت حوالي 5 ساعات (انظر الجدول 1). هذا الوقت كافي لتدفق الهضم لتجاوز الحاجز الحمضي لمعدة الكلاب.

لم يلاحظ أي نشاط استقلابي بكتيري في حالة عينات طعام الكلاب الجافة غير المخففة التي تم تحليلها ،     (NCIMB10415) انظر الشكل ١. أيضًا ، لم يُظهر تركيز مسحوق البكتيريا المعوية المجففة بالتجميد

.(العينات الجافة والمخففة) أي نشاط حراري (البيانات غير معروضة)

٤. الخلاصة

أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها بوضوح قدرة سلالة البكتيريا البروبيوتيك المعوية البرازية

 الموجودة في أطعمة الكلاب المبثوقة في الحفاظ على خصائصها الحيوية والنمو  (NCIMB10145)

 عند درجة الحموضة الحمضية والمتعادلة. يشير هذا إلى أن الأطعمة المبثوقة التي تحتوي على بكتيريا

 قادرة على تحمل الحاجز الحمضي لمعدة الكلب مع مزيد من الاستعمار الناجح لأمعاء E. faecium

الكلب.

أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها أن تقنية القياس الحراري هي طريقة مستقبلية وحساسة للمراقبة المستمرة في الموقع للنشاط البكتيري في مثل هذه المصفوفات المعقدة مثل العلف المبثوق أو المنتجات الغذائية ، ولتحديد العمر الافتراضي لمكونات البروبيوتيك في المنتجات.

٥. شكر وتقدير

من مؤسسة العلوم الإستونية ، ومن خلال المنحة ETF9192 تم دعم هذا التحقيق ماليًا من خلال المنحة

من وزارة التعليم والبحوث الإستونية ، ومن خلال مشروع صندوق التنمية الإقليمي SF0140090s08

. EU29994 الأوروبي

 على تقديم عينة من (المملكة المتحدة) Probiotics International Ltd يرغب المؤلفون في شكر

البكتيريا المركزة و باكترفيلد س.أ. (لوكسمبورغ) لتوفير عينات طعام الكلاب.

Source: Advances in Microbiology, 2012, 2, 436-440 http://dx.doi.org/10.4236/aim.2012.24055 Published Online December 2012 (http://www.SciRP.org/journal/aim)

مراجع

[1]S.D. Forssten, C.W. Sindelar, A.C. Ouwehand, “Probiotics from an industrial perspective,” Anaerobe, Vol. 6, 2011, pp. 410-3. doi:10.1016/j.anaerobe.2011.04.014

[2]A.C. Ouwehand, “Recent advances in probiotic research: a conference update,” Future Microbiology, Vol. 9, 2011, pp. 981-4. doi:10.2217/fmb.11.76

[3]W. Kneifel and S. Salminen, “Probiotics and Health Claims,” Wiley-Blackwell, UK, 2011. doi:10.1002/9781444329384

[4]L. Yi, L. Xi, Q. Songsheng, S.J. Ping, “Microcalorimetric investigation of the toxic action of Cd2+ on Rhizopus nigricans growth,” Journal of Biochemical and Biophysical Methods , Vol. 45, 2000, pp. 231–239. doi:10.1016/S0165-022X(00)00115-9

[5]L. Gustafsson, “Microbiological calorimetry,” Thermochimica Acta, Vol. 193 , 1991, pp. 145–171. doi:10.1016/0040-6031(91)80181-H

[6]H. Vandenhove,“Microclaorimetric characterization of bacterial inocula,” Advanced Instrumentation, Data Interpretation, and Control of Biotechnological Processes, Vol. 25, 1998, pp.121–158.

[7]I. Lamprecht, “Calorimetry and thermodynamics of living systems,” Thermochimica Acta, Vol. 405, 2003, pp. 1–13. doi:10.1016/S0040-6031(03)00123-0

[8]L. Wadsö, F.G. Galindo, “Isothermal calorimetry for biological applications in food science and technology,” Food Control, Vol. 20, 2009, pp. 956–961. doi:10.1016/j.foodcont.2008.11.008

[9]N. Kabanova, A. Kazarjan, I. Stulova, R. Vilu, “Microcalorimetric study of growth of Lactococcus lactis IL1403 at different glucose concentrations in broth,” Thermochimica Acta, Vol. 496, 2009, pp. 87–92. doi:10.1016/j.tca.2009.07.003

[10]N. Kabanova, I. Stulova, R. Vilu, “Microcalorimetric study of the growth of bacterial colonies of Lactococcus lactis IL1403 in agar gels,” Food Microbiology, Vol. 29, 2012, pp. 67-79. doi:10.1016/j.fm.2011.08.018

[11]D.A. Mitchell, O.F. von Meien, N. Krieger, F.D.H. Dalsenter, “A review of recent developments in modeling of microbial growth kinetics and intraparticle phenomena in solid-state fermentation,” Biochemical Engineering Journal, Vol. 17, 2004, pp. 15–26. doi:10.1016/S1369-703X(03)00120-7

[12]I. Stulova, N. Kabanova, T. Kriščiunaite, T.-M. Laht, R. Vilu, “The effect of milk heat treatment on the growth characteristics of lactic acid bacteria,” Agronomy Research, Vol. 9, 2011, pp. 473–478.

[13]A. Mihhalevski, I. Sarand, E. Viiard, A. Salumets, T. Paalme, Growth characterization of individual rye sourdough bacteria by isothermal microcalorimetry,” Journal of Applied Microbiology, Vol. 110, 2011, pp. 529-540. doi:10.1111/j.1365-2672.2010.04904.x

[14]M. Riva, D. Fessas, A. Schiraldi, “Isothermal calorimetry approach to evaluate shelf life of foods,” Thermochimica Acta, Vol. 370, 2001, pp. 73–81. doi:10.1016/S0040-6031(00)00782-6

[15]C. Alklint, L. Wadso, I. Sjoholm, “Accelerated storage and isothermal microcalorimetry as methods of predicting carrot juice shelf-life,” Journal of the Science of Food and Agriculture, Vol. 85, 2005, pp. 281–285. doi:10.1002/jsfa.1942

[16]U. von Stockar, L.A.M. van der Wieler, “Thermodynamics in biochemical engineering,” Journal of Biotechnology, Vol. 59, 1997, pp. 25-37. doi:10.1016/S0168-1656(97)00167-3

[17]M. Antwi, K. Barnaerts, J.F. Van Impe, A.H. Geeraerd, “Modelling the combined effects of structured food model system and lactic acid on Listeria innocua and Lactococcus lactis growth in mono- and coculture,” International Journal of Food Microbiology, Vol. 120, 2007, pp. 71–84. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.04.015

[18]P.D.G. Wilson, T.F. Brocklehurs, S. Arino, D. Thuault, M. Jakobsen, M. Lange, J. Farkas, J.W.T. Wimpenny, J.F. Van Impe, “Modelling microbial growth in structured foods: towards a unified approach,” International Journal of Food Microbiology, Vol. 73,2002, pp. 275–289. doi:10.1016/S0168-1605(01)00660-2

[19]M. Akimoto, N. Nagahata, A. Furuya, K. Fukushima, S. Higuchi, T. Suwa, “Gastric pH profiles of beagle dogs and their use as an alternative to human testing,” European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol. 49, 2000, pp. 99-102. doi:10.1016/S0939-6411(99)00070-3

[20]D.G. Carlson and J.M. Griffin, “Dog Owner's Home Veterinary Handbook,” Howell, New York, 1992.

[21]T. Kimura, K. Takahashi, “Calorimetric studies of soil microbes: quantitative relation between heat evolution during microbial degradation of glucose and changes in microbial activity in soil,” Journal of general microbiology, Vol. 131, 1985, pp. 3083-3089.

[22]S. Bayne-Jones, H.S. Rhees, “Relationship of heat production to phases of growth of bacteria,” Journal of Bacteriology, Vol. 17, No. 2, 1929, pp. 123–140.

[23]“Opinion of the Scientific Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed on the safety of product Oralin for dogs,” The European Food Safety Authority Journal, Vol. 51, 2004, pp. 1-6